神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma，NB)是起源于胚胎期神經(jīng)嵴細(xì)胞的兒童惡性腫瘤，自然退化常見于新生兒、嬰兒和早期腫瘤，而較大兒童晚期患者惡性程度高，預(yù)后差。對(duì)化療耐藥是治療失敗的主要原因［1］。如何應(yīng)用人為方法使NB細(xì)胞分化、逆轉(zhuǎn)、消退，是當(dāng)今腫瘤界研究的熱點(diǎn)問題［2］，用藥物誘導(dǎo)NB向良性轉(zhuǎn)化可能成為臨床治療的一個(gè)新途徑。

　　1 資料與方法

　　1.1 一般資料

　　5歲男性患兒，因發(fā)現(xiàn)“腹部腫物”1周，于2004年6月10日入住本院，行腹部B超、CT檢查，考慮為神經(jīng)源性腫瘤；于2004年6月12日行剖腹探查、腹部腫物切除術(shù)。手術(shù)標(biāo)本冰凍切片提示神經(jīng)母細(xì)胞瘤。為Evans分期Ⅲ期，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，術(shù)后病理診斷：神經(jīng)母細(xì)胞瘤。

　　1.2 研究方法

　　(1)試劑：NGF購(gòu)自晶美公司；MTT購(gòu)自華美公司。其它均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭�。Trizol購(gòu)自美國(guó)GBICO公司；RT-PCR試劑盒購(gòu)自Promega公司；TaqDNA合成酶、瓊脂粉購(gòu)自上海生工生物工程公司；DNAMarker購(gòu)自寶生物工程大連公司；引物TrkA引物序列根據(jù)Genebank資料設(shè)計(jì)如下：TrkAsense:CTGGGCGGAGTGCCTGAA，antisense：GGCTC-CGGCTCCAGGAA，擴(kuò)增產(chǎn)物為528bp，TrkA引物及β-actin(114bp)內(nèi)參照引物由北京賽百盛公司合成。(2)NB細(xì)胞培養(yǎng)：用消化法進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM，含10%胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素0.1mg/ml，在5%CO2、95%空氣環(huán)境中恒溫恒濕孵育。(3)實(shí)驗(yàn)分組：用作生長(zhǎng)及分化研究的NB細(xì)胞分成4組。A組：DMEM培養(yǎng)基加入NGF使終濃度為5μmol/L；B組：DMEM培養(yǎng)基加入NGF使終濃度為10μmol/L；C組：DMEM培養(yǎng)基加入NGF使終濃度為20μmol/L；D組：作為對(duì)照組，培養(yǎng)基中不加NGF干預(yù)。每組設(shè)4份同樣的標(biāo)本。(4)活細(xì)胞計(jì)數(shù)：取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種至24孔培養(yǎng)板,細(xì)胞濃度為1×105細(xì)胞/ml，于0、2、4、6、8d用臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞。(5)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：用作分化研究的細(xì)胞，以1×103/ml密度接種至25ml培養(yǎng)瓶中，A、B、C、D組同時(shí)接種，于0、2、4、6、8d在相差顯微鏡下計(jì)數(shù)分化細(xì)胞。方法：對(duì)每瓶細(xì)胞選取5個(gè)不同視野的200個(gè)細(xì)胞，根據(jù)Sandquist法，有一個(gè)或一個(gè)以上的軸突長(zhǎng)度延伸至胞體直徑二倍以上者為細(xì)胞分化，計(jì)算細(xì)胞分化百分率。(6)MTT法檢測(cè)NB細(xì)胞增殖活性原理：活細(xì)胞，特別是增殖的細(xì)胞中，其中線粒體能量代謝中產(chǎn)生的琥珀酸脫氫酶可將淡黃色的四甲基偶氮唑鹽(MTT)還原成藍(lán)紫色的結(jié)晶沉積在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周圍，形成的結(jié)晶與細(xì)胞數(shù)成正比，用酸化異丙醇溶解結(jié)晶即可在酶標(biāo)比色計(jì)上直接比色，此數(shù)值的升高標(biāo)志細(xì)胞能量代謝旺盛、增殖活躍。檢測(cè)方法：細(xì)胞培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h使細(xì)胞貼壁，按A、B、C、D組要求加入NGF，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；吸去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞一次；每孔加濃度5mg/ml的MTT染液20μl(溶于PBS中，濾過除菌，4℃避光保存)于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育細(xì)胞4～6 h；加入新鮮配制的DMSO溶解MTT 150μl/孔，水平搖床上搖10min，使還原產(chǎn)物充分溶解，酶標(biāo)儀上570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值。(7)TrkA表達(dá)檢測(cè)：①NB細(xì)胞總RNA的提取：將培養(yǎng)的細(xì)胞用Trizol提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)吸光度OD260值和OD280值，計(jì)算提取物濃度及純度。經(jīng)定量后用DEPC水稀釋至1mg/ml，-20℃保存。②逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟合成cDNA。③PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：反應(yīng)體系為25μl，PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5min，變性1min，55℃退火45s，72℃延伸2min，共35個(gè)循環(huán)。④擴(kuò)增產(chǎn)物半定量分析：取10μl擴(kuò)增產(chǎn)物在含溴化乙錠(0.5μg/ml)的2%瓊脂糖凝膠中電泳，紫外透射儀觀察RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，與Marker比較鑒定結(jié)果，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描擴(kuò)增帶，用TrkA/β-actin比值表示TrkA的相對(duì)表達(dá)水平。

　　1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

　　用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，兩均數(shù)比較采用校正t檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果

　　2.1NGF誘導(dǎo)NB細(xì)胞分化觀察

　　NB細(xì)胞呈小梭形，部分呈淚滴狀，少數(shù)呈三角形。經(jīng)NGF干預(yù)后，2d后開始出現(xiàn)形態(tài)分化，細(xì)胞變短、變圓，逐漸有神經(jīng)突起形成，類似樹突、軸突，整個(gè)細(xì)胞形態(tài)由原來的小梭形變?yōu)轭惗噙呅危�類似成熟的神�?jīng)節(jié)細(xì)胞。不同作用時(shí)間、不同濃度NGF干預(yù)的細(xì)胞分化百分率見表2。表2 不同作用時(shí)間、不同濃度NGF對(duì)NB細(xì)胞分化百分率的影響（略）注：*P<0.05 vs D組；#P<0.05 vs A組；▲P<0.05 vs B組

　　2.2 MTT檢測(cè)結(jié)果顯示NGF劑量依賴性的抑制NB細(xì)胞的增殖。

　　2.3 不同濃度NGF對(duì)TrkAmRNA/β�瞐ctin比值的影響。NGF不同濃度誘導(dǎo)后，隨著作用時(shí)間和濃度的增長(zhǎng)，TrkAmRNA表達(dá)均增強(qiáng)，與作用時(shí)間和NGF濃度正相關(guān)。

    本研究中NGF時(shí)間和劑量依賴性的促進(jìn)TrkAmRNA表達(dá)，并使分化細(xì)胞的百分比顯著升高，證實(shí)其具有通過誘導(dǎo)TrkA高表達(dá)而引起NB細(xì)胞分化的功能。TrkA主要由一種跨膜酪氨酸激酶gp140trk組成，它是原癌基因Trk的產(chǎn)物。當(dāng)NGF與TrkA結(jié)合后，通過RAS/MAPK信號(hào)通路的激活，影響基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，表現(xiàn)為對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控。本研究中NGF使活細(xì)胞數(shù)減少，劑量依賴性的抑制細(xì)胞增殖。NGF與TrkA間的相互作用是影響惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和擴(kuò)展、播散的重要因素，TrkA與其配體NGF結(jié)合引發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)的瀑布式級(jí)鏈反應(yīng)。本研究證實(shí)NGF可在體外誘導(dǎo)NB瘤細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化，在NB患兒向成熟方向分化過程中起到重要作用。近年來的研究表明，TrkA所介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路在NGF誘導(dǎo)包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤在內(nèi)的多種神經(jīng)源性體外培養(yǎng)細(xì)胞分化過程中起到較為決定性的作用

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