桂芍鎮(zhèn)癇片由白芍、黨參、柴胡等9味中藥組方而成,用于治療各種發(fā)作類型的癲癇,為《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)•中藥成方制劑》第3冊(cè)收載的品種(WS3-B-2591-97)。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只有黃芩、白芍的鑒別,無(wú)含量測(cè)定。為了更好地控制本品質(zhì)量,本試驗(yàn)對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究。采用薄層色譜(TLC)法對(duì)制劑中的甘草、黨參及柴胡進(jìn)行了鑒別,采用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)制劑中君藥白芍的主要成分芍藥苷進(jìn)行了含量測(cè)定。

    1 儀器與試藥

    LC-20AT高效液相色譜儀,包括SPD-20A檢測(cè)器、Labsolution色譜數(shù)據(jù)處理工作站(日本島津)；賽多利斯電子天平(1/100 000,德國(guó))；KQ-250DE數(shù)控型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

    甘草次酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)110723-200411)；黨參對(duì)照藥材(供鑒別用,中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)121057-200303)；柴胡對(duì)照藥材(供鑒別用,中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)120992-0301)；芍藥苷對(duì)照品(供含量測(cè)定用,中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)110736- 200423)；桂芍鎮(zhèn)癇片樣品(自制,批號(hào)060811、060812、060813)。乙腈為色譜純,水為重蒸水；其他試劑均為分析純。

    2 定性鑒別

    2.1 甘草的鑒別

    取本品10片,除去薄膜衣,研細(xì),稱取細(xì)粉3 g,加氯仿40 mL, 回流提取30 min,濾過(guò),濾渣揮干溶劑,加甲醇40 mL,回流提取1 h,濾過(guò),濾液蒸干,殘?jiān)�加�?0 mL使溶解,用水飽和的正丁醇提取3次,每次20 mL,合并正丁醇液,用正丁醇飽和的水洗滌2次,每次20 mL,合并正丁醇液,蒸干,殘?jiān)�加甲�? mL使溶解,作為供試品溶液。另取甘草次酸對(duì)照品,加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[《中華人民共和國(guó)藥典》2005年版(一部)附錄ⅥB]試驗(yàn),吸取供試品溶液5～10 μL、對(duì)照品溶液4 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以石油醚(30～60 ℃)-甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(10∶20∶7∶0.5)為展開(kāi)劑[1],展開(kāi),取出,晾干,噴以10 %磷鉬酸乙醇溶液,在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中,在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn)。

    2.2 黨參的鑒別

    取本品10片,除去薄膜衣,研細(xì),稱取細(xì)粉3 g,加正丁醇50 mL,超聲處理30 min,濾過(guò),濾液濃縮至約0.5 mL,作為供試品溶液。另取黨參對(duì)照藥材2 g,加水20 mL,微沸煮40 min,濾過(guò),濾液用正丁醇30 mL振搖提取,正丁醇液濃縮至1 mL,作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法[《中華人民共和國(guó)藥典》2005年版(一部)附錄ⅥB]試驗(yàn),吸取供試品溶液和對(duì)照藥材溶液各5 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以正丁醇-無(wú)水乙醇-水(15∶3∶2)為展開(kāi)劑[2],展開(kāi),取出,晾干,噴以10%硫酸乙醇,于105 ℃下加熱。供試品色譜中,在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn)。

    2.3 柴胡的鑒別

    取本品10片,除去薄膜衣,研細(xì),稱取細(xì)粉3 g,置具塞錐形瓶中,加甲醇50 mL,超聲處理30 min,濾過(guò),濾液蒸干,殘?jiān)�加�?0 mL使溶解,并轉(zhuǎn)移到分液漏斗中,用水飽和的正丁醇提取3次,每次40 mL,合并正丁醇液,用氨試液40 mL洗滌,棄去氨液,正丁醇層蒸干,殘?jiān)�加甲�? mL使溶解,作為供試品溶液。取柴胡對(duì)照藥材1 g,加水微沸30 min,濾過(guò),濾液濃縮至約30 mL,轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,余項(xiàng)操作同供試品,即得對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法[《中華人民共和國(guó)藥典》2005年版(一部)附錄ⅥB]試驗(yàn),吸取供試品溶液和對(duì)照藥材溶液各10 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以乙酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶1)為展開(kāi)劑[3],展開(kāi),取出,晾干,噴以10%磷鉬酸乙醇溶液,在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中,在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn)。

    3 含量測(cè)定

    3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

    色譜柱為DiamonsilTMC18(5 μm,200 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相為乙腈-0.1%醋酸溶液(15∶85),流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；柱溫為室溫。理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000；分離度R＞1.5。

    3.2 溶液的制備

    3.2.1 對(duì)照品溶液

    精密稱取芍藥苷對(duì)照品12.26 mg,置100 mL量瓶中,加甲醇適量使溶解,定容,搖勻,精密量取5.0 mL,置10 mL量瓶中,加甲醇定容,搖勻,經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò),即得。

    3.2.2 供試品溶液

    取桂芍鎮(zhèn)癇片10片,除去薄膜衣,研細(xì),取細(xì)粉0.2 g,精密稱定,置50 mL量瓶中,加稀乙醇35 mL,超聲處理((功率250 W,頻率40 kHz),放冷,加稀乙醇定容,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò),即得。

    3.2.3 陰性對(duì)照品溶液

    按處方組成及制備工藝制備不含芍藥的樣品,按“3.2.2”項(xiàng)下方法處理,即得。

    3.3 空白干擾試驗(yàn)

    按上述色譜條件,分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液,注入液相色譜儀,測(cè)定。結(jié)果在供試品色譜中,在與對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上有相同保留時(shí)間的色譜峰,而陰性對(duì)照品溶液在此無(wú)峰,見(jiàn)圖1。芍藥苷與其他組分分離良好,說(shuō)明陰性樣品對(duì)芍藥苷含量測(cè)定無(wú)干擾。

    3.4 線性范圍考察

    精密吸取對(duì)照品溶液4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 μL,按上述色譜條件測(cè)定,記錄色譜圖,以峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得回歸方程為：Y＝1 547 954X＋14 289 (r＝0.999 7)。結(jié)果表明,芍藥苷在0.245 2～0.735 6 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    3.5 精密度試驗(yàn)

    精密吸取對(duì)照品溶液10 μL,按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次,記錄色譜圖,計(jì)算。結(jié)果RSD＝0.81%,表明本法精密度較好。

    3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

    精密吸取供試品溶液10 μL,按上述色譜條件測(cè)定,分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣,記錄色譜圖,測(cè)定峰面積,計(jì)算。結(jié)果RSD＝1.04%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

    3.7 重復(fù)性試驗(yàn)

    取同一批樣品(批號(hào)060811)5份,按“3.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按上述色譜條件測(cè)定,記錄色譜圖,測(cè)定峰面積,計(jì)算。結(jié)果本品平均含量為13.06 mg/g(RSD＝1.10%),表明本方法重復(fù)性良好。

    3.8 加樣回收率試驗(yàn)

    取已知含量的樣品(批號(hào)060811,含量13.06 mg/g),除去薄膜衣,研細(xì),取0.1 g,精密稱定,置50 mL量瓶中,精密加入芍藥苷對(duì)照品溶液10 mL(濃度為0.122 6 mg/mL),其余按“3.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按上述色譜條件測(cè)定,記錄色譜圖,計(jì)算,結(jié)果見(jiàn)表1。本方法回收率在96.7%～100.3%之間,RSD＝1.52%,表明方法的準(zhǔn)確性較好。

    3.9 樣品測(cè)定

    取3個(gè)批號(hào)(060811、060812、060813)的樣品,平行2份,按“3.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。精密量取對(duì)照品、供試品溶液各10 μL,按上述色譜條件測(cè)定,測(cè)定峰面積,計(jì)算。結(jié)果3個(gè)批號(hào)樣品中芍藥苷的平均含量分別為4.12、4.09、4.08 mg/片。

    4 討論

    曾試驗(yàn)了甲醇-0.1 %磷酸溶液(35∶65)、甲醇-水(30∶70)及乙腈-0.1%醋酸溶液(25∶75)等流動(dòng)相系統(tǒng),結(jié)果均不理想。而流動(dòng)相為乙腈-0.1%醋酸溶液(15∶85)時(shí),具有較好的分離度和適宜的保留時(shí)間,故以此作為含量測(cè)定的流動(dòng)相。

    在篩選樣品中芍藥苷的提取條件時(shí),比較了稀乙醇加熱回流法和超聲提取法,結(jié)果超聲提取方便、迅速,超聲30 min即可提取完全,故樣品的處理采用超聲提取30 min。

    以TLC法對(duì)制劑中的甘草、黨參及柴胡進(jìn)行定性鑒別,斑點(diǎn)清晰,專屬性好,無(wú)陰性干擾。芍藥苷為白芍中的主要成分,可用來(lái)作為中成藥中白芍的定量指標(biāo)成分。所建立的HPLC法測(cè)定芍藥苷含量簡(jiǎn)便、重復(fù)性好,可作為控制本品質(zhì)量的指標(biāo)。

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