山苦茶(Mallotus furetianus)是大戟科野桐屬植物，產(chǎn)于海南各地，具有清熱解毒、利膽消食等功效［1］。山苦茶可以促進(jìn)膽汁的合成和排泄，有助于膽石的排除，對(duì)膽道疾病的患者取得較好的臨床效果［2］，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，山苦茶組分B、D具有顯著的利膽作用［3］。動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是以高脂血癥、脂質(zhì)代謝紊亂，引起脂質(zhì)過(guò)氧化，損傷動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，形成粥樣斑塊為特征的疾病。本文研究山苦茶組分B、D對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血管內(nèi)皮功能的影響及可能的機(jī)制。

　　1 材料與方法

　　1.1 動(dòng)物

　　健康雄性Wistar大鼠90只，體重200～300g，由長(zhǎng)春高新醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心提供，合格證號(hào)：SCXK-(吉)2003-0004。

　　1.2 藥品與試劑

　　山苦茶葉中兩種不同的提取部位B和D，由海南醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室提供。二苯代苦味肼基自由基（DPPH）（Fluka公司）；無(wú)水乙醇（分析純，廣州試劑廠）；羧甲基纖維素鈉（上海黃河制藥廠）；膽固醇（北京化學(xué)試劑公司）；豬膽鹽（北京化學(xué)試劑公司）；它巴唑（上海復(fù)星朝暉藥業(yè)有限公司）；維生素 D3（上海通用藥業(yè)股份有限公司）；維生素 E（上海金伴藥業(yè)有限公司）；苯腎上腺素（PHE）（上海禾豐制藥有限公司）；乙酰膽堿（ACh）（上海試劑三廠）；過(guò)氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒、一氧化氮合酶（NOS）測(cè)定試劑盒、丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒由南京建成生物工程研究所第一分所提供。

　　1.3 儀器

　　721分光光度計(jì)（上海第三儀器分析儀器廠）；LXJ-Ⅱ型高速離心機(jī)（上海醫(yī)用分析儀器廠）；HANGPING FA1104電子分析天平：上海天平儀器廠；電熱恒溫水浴鍋：上海醫(yī)療器械五廠；BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)、HW-400S恒溫平滑肌浴槽：成都泰盟科技有限公司。

　　1.4 方法

　　1.4.1 山苦茶不同組分清除自由基測(cè)試［4,5］

　　將DPPH以無(wú)水乙醇為溶劑配制為6×10-4mol/L的儲(chǔ)液，放置于4℃冰箱，臨用前用同一溶劑將其稀釋為6×10-5mol/L待用。將山苦茶B、D及維生素C以無(wú)水乙醇為溶劑分別配成150、25和0.04g/L，然后將B、D梯度稀釋為0.5、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.005和0.001g/L，將維生素C梯度稀釋為0.04、0.02、0.01和0.005g/L，取上述各組分0.5ml，與2.5ml DDPH反應(yīng)，反應(yīng)總體積3.0ml，于1cm比色杯中，517nm處測(cè)吸光度，每一吸光度平行測(cè)3次，取平均值，計(jì)算自由基清除率及自由基清除率為50％時(shí)各組分的濃度，即EC50。表1 DDPH加樣表（略）

　　清除率％＝（1-Ai-AjA0）×100％

　　1.4.2 山苦茶不同組分對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠抗氧化能力及血管內(nèi)皮功能的影響

　　將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、維生素E(0.20g/kg)、山苦茶B高劑量組0.081g/kg、山苦茶B低劑量組0.026g/kg和山苦茶D 0.057g/kg。各藥物均以0.5％羧甲基纖維素鈉為溶劑配制。除正常對(duì)照組外，其余各組給予高脂飼料飼養(yǎng)，同時(shí)灌胃給予相應(yīng)的藥物，給藥容積為10ml/kg體重；正常對(duì)照組和模型組給予相應(yīng)體積的0.5％羧甲基纖維素鈉。取Wistar大鼠90只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽取15只作為正常對(duì)照組，普通飼料(長(zhǎng)春高新醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心提供)喂養(yǎng)，飲自來(lái)水；其余各組大鼠一次性腹腔注射VD370萬(wàn)U/kg，高脂飼料(2%膽固醇＋0.5%豬膽鹽＋0.2%它巴唑＋5%白糖＋10%豬油＋82.3%普通飼料)飼養(yǎng)9周（在楊彭遠(yuǎn)等［6］基礎(chǔ)上有所改變），飲用自來(lái)水。

　　1.4.3 抗氧化能力測(cè)定

　　給藥9周末，各組大鼠以戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，經(jīng)頸總動(dòng)脈插管取血。1 000rpm離心15min，取上清。黃嘌呤氧化法測(cè)定SOD活性；硫酸巴比妥比色法測(cè)定MDA；化學(xué)比色法測(cè)NOS；具體操作按南京建成試劑盒要求進(jìn)行。

　　1.4.4 內(nèi)皮依賴性血管舒張實(shí)驗(yàn)［7］

　　大鼠采血后，迅速取出胸主動(dòng)脈，制成寬3mm的胸主動(dòng)脈環(huán)，保留血管內(nèi)膜，置于通0.95 O2+0.05 CO2混合氣體、pH7.4 的正常Krebs 液的浴槽中。此液配制為(mmol/L)：NaCl 115.0；KCl 4.6；MgSO4 1.16；NaH2PO4 1.16；NaHCO3 21.9；CaCl2 2.5；葡萄糖11.0。標(biāo)本負(fù)荷2.0g，平衡2h，每20min 換營(yíng)養(yǎng)液1次。在采集資料前,主動(dòng)脈環(huán)用60mmol/L KCl 液每隔20min 收縮一次,直至標(biāo)本收縮反應(yīng)可重現(xiàn)。用1μmol/L PHE收縮標(biāo)本，待收縮達(dá)坪值后，按累積濃度法加入ACh，記錄ACh 每一累積濃度時(shí)血管舒張效應(yīng)，以PHE 引起收縮的松弛率表示ACh的血管舒張效應(yīng)。

　　1.4.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

　　結(jié)果以x±s表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行單因素方差分析，計(jì)量資料采用組間t檢驗(yàn)(方差不齊時(shí)用t’檢驗(yàn))。

　　2 結(jié)果

　　2.1 山苦茶各組分對(duì)DPPH自由基清除能力的比較

　　山苦茶各組分對(duì)DPPH自由基清除EC50的比較：山苦茶B >維生素 C >山苦茶D。具體見(jiàn)表2。表2 山苦茶B、D清除DDPH能力與維生素C比較的t值組別EC50（略）

　　2.2 山苦茶各組分對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠抗氧化能力的影響

　　模型組大鼠SOD、NOS較正常組明顯降低（P＜0.01）；MDA較正常組明顯增加（P＜0.05）；山苦茶B、山苦茶D、維生素 E均能明顯增加動(dòng)脈粥樣硬化大鼠的SOD、NOS活性，降低MDA。其中，山苦茶D對(duì)SOD、MDA影響最為顯著，山苦茶B 低劑量對(duì)NOS的影響最為顯著，具體見(jiàn)表3。表3 山苦茶各組分對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠抗氧化能力的影響(略)注：與模型組比較,P＜0.05,P＜0.01；與正常組比較,△P＜0.05,△△P＜0.01。

　　2.3 山苦茶各組分對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠內(nèi)皮依賴性血管舒張實(shí)驗(yàn)的影響

　　模型組大鼠對(duì)ACh引起的內(nèi)皮依賴性血管松弛作用明顯降低，山苦茶B、山苦茶D、維生素E均能改善動(dòng)脈粥樣大鼠ACh引起的內(nèi)皮依賴性血管松弛作用，其中，以山苦茶D的作用最為顯著，具體見(jiàn)表4。表4 山苦茶各組分對(duì)Ach引起的內(nèi)皮依賴性松弛作用(略)

　　3 討論

　　以動(dòng)脈粥樣硬化（AS）為病理基礎(chǔ)的心腦血管疾病是當(dāng)今發(fā)病率和病死率最高的疾病，Ross［8］于1999年在其“損傷反應(yīng)學(xué)說(shuō)”基礎(chǔ)上提出，AS是一種炎癥反應(yīng)性疾病，其病理表現(xiàn)為變質(zhì)、滲出、增生。高血壓、高血糖、高脂血癥、脂質(zhì)過(guò)氧化都是AS炎癥的誘發(fā)因素。近年來(lái)，氧化低密度脂蛋白（OX-LDL）與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系越來(lái)越受到人們的關(guān)注。高脂血癥引起脂質(zhì)代謝紊亂，LDL增多，LDL的氧化產(chǎn)物OX-LDL增多。OX-LDL損傷動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，使內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)LDL的通透性增加，胞漿發(fā)生空泡變性,漿膜皺縮,甚至可使細(xì)胞最終壞死。自由基清除實(shí)驗(yàn)表明，山苦茶組分B、D均有清除自由基的作用，其清除自由基能力：山苦茶D>維生素C>山苦茶B。山苦茶組分B、D能明顯降低動(dòng)脈粥樣硬化大鼠的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，提高抗氧化能力，山苦茶B在低劑量即能發(fā)揮抗氧化作用，其抗氧化能力并不隨劑量的增加而提高。山苦茶D抗氧化能力強(qiáng)于山苦茶B，這與自由基清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。山苦茶B、D均能增加NOS活性，增加NO的生成，改善動(dòng)脈粥樣硬化大鼠的血管內(nèi)皮功能。山苦茶組分B、D通過(guò)清除自由基，降低脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，提高動(dòng)脈粥樣硬化大鼠的抗氧化能力，降低動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，減輕AS的炎癥反應(yīng)，改善血管的舒張能力。同時(shí)，山苦茶B、D通過(guò)增加動(dòng)脈粥樣硬化大鼠的NOS活性，增加血管內(nèi)皮細(xì)胞NO的生成，改善ACh引起的內(nèi)皮依賴性血管舒張作用。

　　總之，山苦茶提取物B、D均能夠改善動(dòng)脈粥樣硬化大鼠的內(nèi)皮依賴型血管舒張，這可能與其增強(qiáng)NOS的活性、清除自由基、提高動(dòng)脈粥樣硬化大鼠的抗氧化能力有關(guān)。（參考文獻(xiàn)：山苦茶提取物對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血管內(nèi)皮功能的影響，劉月麗，中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)雜志2008年第8卷第3期 ）

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