熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs），又稱應(yīng)激蛋白，是一類在進(jìn)化上高度保守.廣泛存在于自然界原核、真核細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，其在正常細(xì)胞中呈基礎(chǔ)表達(dá)，執(zhí)行一系列基本的生理功能，參與細(xì)胞的損傷修復(fù)，發(fā)揮應(yīng)激保護(hù)作用.銀屑病屬心身疾病范疇［1，2］ ，它與機(jī)體內(nèi)外環(huán)境急、慢性應(yīng)激刺激密切相關(guān).為了解銀屑病患者在疾病演變過程中HSPs的變化及相互關(guān)系，我們應(yīng)用LSAB免疫組織化學(xué)方法和真彩色醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，就HSP27，HSP70在銀屑病患者治療前后表皮細(xì)胞中的表達(dá)情況做了研究.

　　目的：研究銀屑病患者治療前后皮損表皮細(xì)胞中HSPs的表達(dá)情況.

　　方法：應(yīng)用LSAB免疫組織化學(xué)法和真彩色醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，測(cè)定25例銀屑病患者皮損、非皮損以及不同治療方法治愈后表皮細(xì)胞中和6例正常人對(duì)照組表皮細(xì)胞中HSP27和HSP70的表達(dá)及含量.

　　結(jié)果：HSP27和HSP70在正常人表皮細(xì)胞中呈基礎(chǔ)表達(dá)（HSP270.100±0.015A;HSP700.094±0.018A），在銀屑病患者皮損中表達(dá)很弱或無表達(dá)（HSP270.068±0.028A;HSP700.034±0.014A），兩者有顯著性差異（P<0.05）;在治愈后表皮中其表達(dá)量逐漸恢復(fù)（HSP270.105±0.028A;HSP700.078±0.022A）;而不同治療方法治愈后其表皮細(xì)胞表達(dá)含量間無明顯差異.

　　結(jié)論：在銀屑病患者皮損中，HSP27和HSP70表達(dá)消失，隨著皮損治愈，HSP27和HSP70表達(dá)逐漸恢復(fù)，提示HSP27和HSP70可能在銀屑病應(yīng)激保護(hù)機(jī)制中發(fā)揮著重要作用.

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　銀屑病患者25（男12，女13）例;年齡14～69（平均35）歲，均為空軍醫(yī)院皮膚科門診及住院患者，臨床和病理確診為尋常型銀屑病;病程1wk～30a，其中靜止期9例，進(jìn)行期16例.患者自愿合作后取材.取材前1mo內(nèi)未服用過皮質(zhì)類固醇、免疫抑制劑及維A酸類藥物，不伴腫瘤及其他嚴(yán)重疾患.每例均用3mm環(huán)鉆取患者背部皮損及相距5cm之非皮損各1塊，1mo后再取治愈后皮膚1塊.其中制銀靈+外用藥治療為11例，迪銀片+外用藥治療為5例;另有3例住院患者在其他治療方法相同的情況下于背部不同局部行靜電治療或外用去炎松治療，治愈后各取皮1塊.正常人對(duì)照6例取自外科非皮膚病手術(shù)的正常皮膚.組織均以40g L-1 甲醛固定24～48h，經(jīng)脫水、透明、浸蠟后，石蠟包埋，室溫下保存.HSP27mAb為美國Neomarker公司產(chǎn)品，購自北京岳泰科技有限公司，HSP70mAb為美國Santa Cruz生物技術(shù)公司產(chǎn)品，它和LSAB免疫組化試劑盒均購自北京中山生物技術(shù)有限公司;真彩色醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)軟件為北京航空航天大學(xué)圖像分析中心與空軍總醫(yī)院聯(lián)合研制.

　　1.2 方法

　　切取5μm厚石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水;1g L-1 胰酶37℃消化30min;三蒸水洗3min×3;30mL L-1 過氧化氫孵育滅活內(nèi)源性過氧化物酶，室溫5min;三蒸水洗，2min×3;pH7.4的PBS緩沖液平衡5min;正常山羊血清封閉，室溫下30min;傾去血清，加入適當(dāng)稀釋一抗（HSP27為1 50PBS稀釋，HSP70為1 100PBS稀釋），4℃過夜;PBS洗5min×3;滴加生物素標(biāo)記二抗，1 300稀釋，37℃孵育30min;PBS洗，5min×3;滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，1 300稀釋，37℃孵育30min;PBS洗，5min×3;DAB顯色;自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、中性樹脂封片.每次實(shí)驗(yàn)均以PBS代替一抗做陰性對(duì)照，以已知結(jié)腸癌組織細(xì)胞核表達(dá)結(jié)果為陽性對(duì)照.圖象定量分析采用多功能真彩色病理圖像分析系統(tǒng)，對(duì)表皮角朊細(xì)胞中熱休克蛋白的表達(dá)進(jìn)行定量檢測(cè)，用單位面積平均吸光度表示熱休克蛋白的相對(duì)含量.

　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x ±s）表示，對(duì)銀屑病皮損、非皮損、治愈后皮膚及正常人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞HSPs抗原表達(dá)強(qiáng)度圖像分析所得到的定量結(jié)果分別進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析.

　　2 結(jié)果

　　正常人組和銀屑病非皮損組、治愈后組表皮中HSP27及HSP70的表達(dá)量均明顯高于銀屑病皮損組（P<0.05）.而正常人組、銀屑病非皮損組及治愈后組表皮中HSP27的表達(dá)量間無明顯差異，HSP70表 達(dá)量在正常人組和銀屑病非皮損組間無明顯差異，但在治愈后組表皮中的含量仍低于正常人組（P<0.05，Tab1）.正常人組與制銀靈治愈后組、迪銀片治愈后組相比，表皮HSP27和HSP70的表達(dá)量無顯著性差異（Tab2）.HSP27和HSP70在正常人組、銀屑病非皮損組、激素外用治愈后組及靜電治愈后組表皮細(xì)胞中的表達(dá)量均明顯高于銀屑病皮損組.而在正常人組、銀屑病非皮損組、激素外用治愈后組和靜電治愈后組表皮細(xì)胞中，HSP27表達(dá)量之間均無顯著性差異，HSP70除在靜電治愈后組表皮細(xì)胞中含量低于正常人組有顯著性差異外（P<0.05），余均無顯著性差異（Tab3）.表1 銀屑病皮損、非皮損和治愈后表皮中HSP27，HSP70的表達(dá)（略）表2 不同po治療方法治愈后表皮中HSP27，HSP70的含量（略）表3 銀屑病皮損、非皮損和不同外用方法治愈后表皮中HSP27，HSP70表達(dá)（略）

　　3 討論

　　以往的研究表明:在正常生理?xiàng)l件下，細(xì)胞中HSPs即呈基礎(chǔ)表達(dá)，它們可作為“分子伴侶”（molec-ular chuperons）發(fā)揮重要的細(xì)胞管家作用，一方面參與基本的蛋白質(zhì)折疊、伸展及胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)［3］ ;另一方面可與細(xì)胞內(nèi)許多功能蛋白，如甾體激素受體、酪氨酸激酶、肌動(dòng)蛋白及微管蛋白等結(jié)合，使其穩(wěn)定在一種失活或未裝配狀態(tài)，達(dá)到特殊部位或受到特定刺激后，再被激活而發(fā)揮作用

　　［4，5］ .另外它們還參與免疫炎癥反應(yīng)，在抗原的加工呈遞、淋巴細(xì)胞的歸巢以及免疫球蛋白的裝配中發(fā)揮作用，它們可與免疫活性因子相互作用、相互制約，使細(xì)胞的內(nèi)外環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定［6］ .當(dāng)正常細(xì)胞受到應(yīng)激傷害時(shí)，細(xì)胞中某些蛋白質(zhì)肽鏈伸展，失去折疊狀態(tài)，而喪失正常功能，甚至發(fā)生不可逆變性，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)大量合成的HSPs可使肽鏈重新折疊恢復(fù)其結(jié)構(gòu)和功能，并可參與降解那些不可逆變性的蛋白，以清除對(duì)細(xì)胞有害的變性產(chǎn)物［7］ .細(xì)胞熱休克應(yīng)激后HSP27和HSP70的高表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞中損傷的蛋白和核仁結(jié)構(gòu)迅速修復(fù)，兩者在細(xì)胞的應(yīng)激保護(hù)效應(yīng)中起到了重要的作用

　　［8-10］ .HSP27主要出現(xiàn)于細(xì)胞增生高峰期和生長(zhǎng)靜止期的開始階段，是細(xì)胞增生停止開始分化的標(biāo)志，可作為角質(zhì)形成細(xì)胞分化程度的標(biāo)志［11-13］ ;而HSP70可在細(xì)胞分裂增生過程中的DNA合成期起作用［14，15］ .

　　我們的測(cè)定結(jié)果表明:HSP27和HSP70在正常人及銀屑病非皮損表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中有明顯胞質(zhì)棕色顆粒狀陽性表達(dá)，其表達(dá)量在這兩組中無顯著性差異，說明在正常人及銀屑病非皮損中，HSP27和HSP70對(duì)維持表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的正常組織形態(tài)有重要作用;在銀屑病皮損表皮中，表皮抗應(yīng)激能力低下，HSP27和HSP70表達(dá)減弱，甚至失表達(dá)，從而在銀屑病應(yīng)激狀態(tài)下失去其應(yīng)激保護(hù)作用，出現(xiàn)銀屑病損害，這與龐曉文等［16-18］ 的研究結(jié)果一致.

　　我們進(jìn)一步研究了采用不同方法治療銀屑病，皮損治愈后表皮中HSP27和HSP70的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)隨著銀屑病皮損的消退，表皮中HSP27和HSP70也恢復(fù)表達(dá)，HSP27在愈后表皮中的表達(dá)量與正常人及銀屑病非皮損無差異，三者均顯著高于銀屑病皮損;HSP70在治愈后表皮中的表達(dá)量仍低于正常人，但高于銀屑病皮損，有顯著性差異.由此可見，雖然銀屑病患者已臨床治愈，但其治愈后的HSP70表達(dá)量仍低于正常;說明臨床治愈后還需一段時(shí)間才會(huì)真正恢復(fù)正常狀態(tài)或有復(fù)發(fā)的可能.愈后表皮HSPs表達(dá)量的恢復(fù)與不同的全身治療方法關(guān)系不明顯，但不同的局部治療方法對(duì)HSPs的恢復(fù)有影響，因例數(shù)較少，尚待繼續(xù)探討.

　　綜上所述，HSP27和HSP70在銀屑病應(yīng)激保護(hù)機(jī)制中可能發(fā)揮著重要作用，深入研究銀屑病皮損表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中HSPs表達(dá)抑制的原因以及HSP27和HSP70在其中所起的不同作用，為理解銀屑病的發(fā)病機(jī)制及尋找理想的治療方法開辟了新的思路.

　　參考來源：《第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)》2001年10月22卷20期；《銀屑病表皮細(xì)胞中熱休克蛋白的表達(dá)意義》；李鈾 ，楊守京，楊雪琴 ，龐曉文，孟如松

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