類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatiod arthritis，RA）的發(fā)病機(jī)制尚不明顯，目前較為認(rèn)可的機(jī)制是機(jī)體內(nèi)T細(xì)胞亞群和B細(xì)胞的失衡等免疫系統(tǒng)紊亂。近來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)機(jī)體內(nèi)存在著一群新型的不同于輔助性T細(xì)胞（TH）1、TH2、TH17及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等的CD T細(xì)胞亞群，由于該細(xì)胞亞群主要分泌白細(xì)胞就（IL）-9，所以將其命名為TH9，最近有學(xué)者提出該細(xì)胞可能與自身免疫病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。目前外周血中CD CD IL- 標(biāo)記的TH9與自身免疫病的發(fā)病機(jī)制研究較少，本實(shí)驗(yàn)旨在初步探討TH9細(xì)胞在RA發(fā)病中可能的作用。

    1 對象與方法
    1.1 研究對象
    選擇2011年1月至7月在安微醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院的36例RA患者，診斷均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會/歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟（ACR/EULAR）2009年RA分類診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者，其中男性7例，女性29例，年齡26~76歲，平均（56±14）歲，病程6個(gè)月至38年，平均（9±8）年。并收集患者的關(guān)節(jié)壓痛數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)、有無晨僵、關(guān)節(jié)畸形、功能障礙、血管炎、雙手X線平片、紅細(xì)胞沉降率（ESR）、C反應(yīng)蛋白（CRP）、類風(fēng)濕因子（RF）、抗環(huán)瓜氨酸肽（CCP）抗體等臨床指標(biāo)數(shù)據(jù)。根據(jù)EULAR推薦的RA疾病活動指數(shù)（DAS）28評分將RA患者分為病情重度活動組（DAS28≥5.1）22例和病情中度活動組（3.2≤DAS28<5.1）14 例；根據(jù)雙手X線定義，≥3級為嚴(yán)重骨質(zhì)破壞，≤2級為無或輕度骨質(zhì)破壞，其中嚴(yán)重骨質(zhì)破壞23例，無或輕度骨質(zhì)破壞13例；心電圖異常包括竇性心動過速，竇性心動過緩，ST-T段壓低，T波異常，其中心電圖異常的16例，無異常20例；有類風(fēng)濕結(jié)節(jié)、皮膚血管炎樣皮疹以及肌電圖提示有神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)異常則定義為有血管炎，其中有血管炎表現(xiàn)的6例，無血管炎表現(xiàn)的30例。健康對照組22例，來自門診體檢的健康自愿者，其中男性7例，女性15例，年齡26~70歲，平均（50±13）歲，2組在年齡及性別上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。本研究符合中國人體試驗(yàn)委員會所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并得到了該委員會的批準(zhǔn)，并取得了試驗(yàn)對象的知情同意。

    1.2 試劑
    異硫氰酸熒光素（FITC）-抗人CD8抗體、藻紅蛋白（PE）-抗人IL-9、別藻藍(lán)蛋白（APC）-抗人CD3抗體、澡紅蛋白標(biāo)記的鼠IgG2b同型對照購自美國eBio-science，佛波酯（PMA）、離子霉素、莫能菌數(shù)（Moen-sin）購自瑞士Alexis公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司，固定劑、破膜劑購自美國Beakman-coulter公司，淋巴細(xì)胞分離液購自天津TBD公司，磷酸鹽緩沖液（PBS）購自歐蒙試劑公司。

    1.3 儀器
    HF90型二氧化碳孵育箱購自上海力申科學(xué)儀器有限公司，低速離心機(jī)系科大創(chuàng)新中佳公司，型號為KDL-40，流式細(xì)胞儀型號為FACScalibur,系美國BD公司產(chǎn)品。

    1.4 方法
    1.4.1 標(biāo)本收集：早晨空腹留取各受試對象肝素鈉抗凝靜脈血4ml，離心留取1ml血漿，置于-80°冰箱中凍存。余下血細(xì)胞以密度梯度法用淋巴細(xì)胞分離液出外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs），用PBS洗滌細(xì)胞兩次。
    1.4.2 細(xì)胞染色及流式細(xì)胞儀發(fā)現(xiàn)：顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及計(jì)數(shù)，并用1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5× /ml。依次加入佛波酯、離子霉素、莫能菌數(shù)，使其終濃度分別為50,1,0.5µg/ml，于 孵育箱中孵育6h后取出，以PBS洗滌2次。將上述培養(yǎng)好的標(biāo)本分別進(jìn)行熒光標(biāo)記抗體的表面染色，每1× /ml細(xì)胞中分別加入抗IL-9澡紅蛋白10µl，4℃避光孵育25min，PBS洗滌后，1500r/min離心5min，棄上清，重復(fù)洗1遍，加入100µl 1%的多聚甲醛固定劑處理后上機(jī)檢測。我們定義CD CD IL- T細(xì)胞為外周血Th9細(xì)胞。
    1.4.3 胞外細(xì)胞因子檢測：IL-9的檢測方法嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）說明書操作。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
    采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行系統(tǒng)分析，對于正態(tài)分布及接近正態(tài)分布的劑量資料用 ±s表示，組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman秩和相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果
    2.1 RA患者外周血中Th9及IL-9的比較：RA患者外周血中TH9表達(dá)率及IL-9水平明顯高于健康對照組，RA患者重度活動組的TH9比例及IL-9水平明顯高于中度活動組，RA患者組的Th9比例及IL-9水平均明顯高于健康對照組（P<0.05）。
    2.2 RA患者外周血中Th9與各臨床指標(biāo)的相關(guān)性：Th9的表達(dá)水平與患者的關(guān)節(jié)壓痛數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)、ESR、CRP、DAS28及RF呈正相關(guān)，亦與血清中IL-9水平呈正相關(guān)（P均<0.05）；而與病程、晨僵、抗CCP抗體、心電圖異常、骨質(zhì)破壞程度以及有無血管炎無相關(guān)性（<0.05）。
    2.3 RA患者血漿中的IL-9與各臨床指標(biāo)的相關(guān)性：RA患者IL-9的水平與患者的關(guān)節(jié)壓痛數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)、ESR及DAS28呈正相關(guān)（P <0.05）；而與病程、晨僵、CRP、抗CCP抗體、RF、心電圖異常、骨質(zhì)破壞程度以及有無血管炎無相關(guān)性（<0.05）。

    3 討論
    過去一直認(rèn)為IL-9屬于Th2類細(xì)胞因子，可作用于多種炎癥細(xì)胞和組織細(xì)胞中，在對抗寄生蟲感染和誘導(dǎo)過敏性疾病，尤其是在過敏性哮喘中發(fā)揮著重要的作用。2008年Veldhoen和Dardalhon幾乎同時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）- 聯(lián)合IL-4刺激CD 初始T細(xì)胞可誘導(dǎo)出一類新型效應(yīng)性獨(dú)立的T細(xì)胞亞群，可特異性分泌大量IL-9，命名為“Th9”細(xì)胞，系CD T細(xì)胞家族一新成員，并通過體外實(shí)驗(yàn)證明TGF- 能夠誘導(dǎo)已經(jīng)分化為Th2的細(xì)胞重新分化為Th9。進(jìn)一步功能研究發(fā)現(xiàn)，Th9細(xì)胞在共刺激分子的作用下具有比初始T細(xì)胞更強(qiáng)的增值能力，但是并不具備免疫抑制功能，體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)提示了該細(xì)胞亞群與自身免疫病關(guān)系密切，主要作用是使炎癥細(xì)胞的數(shù)量上升并分泌一些炎癥介質(zhì)，促進(jìn)炎癥的發(fā)生，最新研究認(rèn)為其特異的轉(zhuǎn)錄因子是PU-1。密切Th9與自身免疫病的確切發(fā)病機(jī)制還尚不清楚，本研究通過檢測RA患者外周血中Th9細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子IL-9的變化特點(diǎn)，分析該細(xì)胞與臨床指標(biāo)及疾病活動的關(guān)聯(lián)性，并探討了該細(xì)胞在RA疾病發(fā)展中可能的作用。

    本研究發(fā)現(xiàn)，RA患者外周血Th9表達(dá)較健康對組組明顯增多，并且隨著病情活動度的增強(qiáng)，Th9的表達(dá)率越高，故推測Th9亦可促進(jìn)RA患者體內(nèi)炎癥的發(fā)生，該細(xì)胞的增多可能是RA反的重要原因。本研究同時(shí)顯示與Th9關(guān)系最密切的細(xì)胞因子IL-9的水平均隨著疾病活動度的增強(qiáng)而升高，同時(shí)RA患者血清中的該細(xì)胞因子水平均明顯高于健康對照組。Xing等研究過敏性哮喘患者體內(nèi)的Th9表達(dá)率及IL-9水平時(shí)發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)的含量明顯高于健康對照組，提出該細(xì)胞可以作用于炎癥細(xì)胞和組織細(xì)胞，使淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞的量增多，提高了IgE分泌，促進(jìn)了炎癥細(xì)胞分泌一些細(xì)胞因子參與炎癥，并推測該細(xì)胞在過敏性哮喘等各種自身免疫病發(fā)生、發(fā)展的過程中起著主要的作用，這一觀點(diǎn)與Li等的看法一致。Zhou等研究多發(fā)性硬化的動物模型，發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)的Th9及IL-9含量亦顯著升高，并且用IL-9體內(nèi)刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞可以引起Th17在局部的積聚，證實(shí)Th9細(xì)胞不但不會抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的增值，而且還有促進(jìn)炎癥發(fā)生的作用，但是與多發(fā)性硬化發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制尚不清楚。目前國內(nèi)外關(guān)于該細(xì)胞研究的熱點(diǎn)是在變態(tài)反應(yīng)性疾病、腫瘤以及多多發(fā)性硬化等免疫性疾病方面，而以RA的臨床相關(guān)性研究尚未見報(bào)道。

    本研究亦發(fā)現(xiàn)Th9的表達(dá)水平與患者的DAS28評分、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)、關(guān)節(jié)壓痛數(shù)、ERS、CRP等炎癥指標(biāo)，及RF這一非特異性的抗體呈正相關(guān)，說明Th9細(xì)胞的過渡表達(dá)可能導(dǎo)致病情活動，進(jìn)一步證實(shí)了Th9可以促進(jìn)體內(nèi)炎癥發(fā)生這一功能。而Th9表達(dá)率與病程無明顯相關(guān)性，說明Th9參與RA整個(gè)病程，貫穿疾病始終。從上述資料可以看出IL-9與DAS28評分、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)、關(guān)節(jié)壓痛數(shù)、ESR等呈正相關(guān)，從而更加證明了Th9大量分泌IL-9，促進(jìn)體內(nèi)炎癥的發(fā)生，以至于誘發(fā)自身免疫病的發(fā)生。Jutel和Akdis發(fā)現(xiàn)在自身免疫病中Th9可誘發(fā)組織炎癥恰好可以解釋本研究中Th9及IL-9均與關(guān)節(jié)壓痛數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)呈正相關(guān)。文獻(xiàn)[3-4]發(fā)現(xiàn)IL-9的表達(dá)與促炎癥因子腫瘤壞死因子（TNF）- 、IL-1、IL-17、干擾素- 有一定的關(guān)聯(lián)，這些細(xì)胞因子與IL-9共同介導(dǎo)炎癥反應(yīng)參與某些自身免疫病的病理過程。在RA患者中，血清IL-9伴隨著細(xì)胞因子TNF- 、IL-1、IL-17、干擾素- 的產(chǎn)生其水平亦上升，表明IL-9與這些促炎癥細(xì)胞因子共同參與了RA的病理過程，推測IL-9是調(diào)節(jié)自身免疫病的炎癥的一種治療靶向。Ciprandi等發(fā)現(xiàn)哮喘患者體內(nèi)IL-9的水平與其癥狀嚴(yán)重程度相關(guān)，故推測IL-9的水平可作為自身免疫病活動的標(biāo)志，與本研究得出的結(jié)果一致。目前國內(nèi)外尚無關(guān)于該細(xì)胞與自身免疫病如RA病情活動度相關(guān)性研究。

    綜上所述，RA患者外周血中Th9表達(dá)率高于健康對照組，而RA中該細(xì)胞的表達(dá)率與病情活動度呈正相關(guān)，同時(shí)高Th9的表達(dá)率可表現(xiàn)出更多的關(guān)節(jié)腫脹、關(guān)節(jié)壓痛、關(guān)節(jié)畸形等臨床表現(xiàn)，更加提示了該群細(xì)胞的過渡表達(dá)也可能參與了RA的起病。而Th9緊密相關(guān)的細(xì)胞因子IL-9其水平與疾病活動度一致，并與疾病相關(guān)炎癥的指標(biāo)呈正相關(guān)，說明該細(xì)胞參與了RA發(fā)病機(jī)制及疾病活動。

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