乙型肝炎病毒基因檢測(cè)技術(shù)（包括定性和定量）尚不完善，有些問題甚至比較嚴(yán)重，亟待解決。近年來，隨著基因檢測(cè)技術(shù)臨床應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大，尤其是在病毒性肝炎的診斷和療效觀察方面，基因檢測(cè)所發(fā)揮的作用越來越大，因此，對(duì)基因診斷技術(shù)本身的要求也越來越高。本文根據(jù)我們的研究積累和臨床實(shí)踐，對(duì)乙型肝炎病毒基因檢測(cè)技術(shù)方面存在的幾個(gè)問題提出一些個(gè)人看法，希望引起重視。
    一、要合理選擇基因檢測(cè)方法
    最常用的基因檢測(cè)方法是雜交法和PCR法，兩種方法各有優(yōu)勢(shì)，但各又有不盡如人意之處。比較肯定的是：雜交法的特異性優(yōu)于PCR法，PCR法的敏感度勝過雜交法。
    目前在檢驗(yàn)方面，膜斑點(diǎn)雜交技術(shù)正逐步被微孔板雜交技術(shù)取代，也正是由于在微反應(yīng)板上操作要比在硝酸纖維膜或尼龍膜上簡(jiǎn)便和精確得多，雜交法基因檢測(cè)技術(shù)再次受到青睞。美國原Chiron公司發(fā)明的bDNA定量檢測(cè)技術(shù)在很短時(shí)間內(nèi)得到普遍認(rèn)可就是很好的例證。bDNA技術(shù)不僅操作簡(jiǎn)便，而且由于采用了信號(hào)放大探針，提高了靈敏度；更由于檢測(cè)系統(tǒng)中的夾心探針系化學(xué)合成的寡核苷酸，特異性進(jìn)一步提高[1,2]。由于成本過高，目前國內(nèi)主要將bDNA技術(shù)用于HBV、HCV基因的定量分析。更多的檢驗(yàn)部門仍采用膜斑點(diǎn)雜交法定性檢測(cè)HBV基因。
    作為一種分子生物學(xué)研究手段，自90年代初以來，PCR技術(shù)對(duì)生命醫(yī)學(xué)的貢獻(xiàn)和還將發(fā)揮的作用是無法估量的，大家熟知的、目前進(jìn)展十分迅速的人類基因組計(jì)劃，如果不依靠PCR技術(shù)來完成基因篩選、克隆和測(cè)序的工作，要在限定的時(shí)間內(nèi)完成這樣一個(gè)龐大的計(jì)劃是不可能的。PCR技術(shù)不僅是一種研究手段，更是一類多功能的檢驗(yàn)技術(shù)。在用于臨床實(shí)驗(yàn)室診斷方面，PCR有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。相對(duì)而言，近幾年來基因定量PCR發(fā)展速度更快，其中競(jìng)爭(zhēng)PCR和熒光PCR似成為當(dāng)前的焦點(diǎn)話題。國內(nèi)已有數(shù)個(gè)試劑公司開發(fā)了定量PCR的產(chǎn)品（包括定量PCR儀）。
    無論是基因定性還是定量檢測(cè)，是選擇雜交法還是PCR法，我們應(yīng)當(dāng)避免人為的好惡，從技術(shù)條件、臨床需要、檢測(cè)成本等多方面綜合考慮。由于經(jīng)驗(yàn)和知識(shí)的局限性，臨床醫(yī)生更多關(guān)心的是檢測(cè)的結(jié)果，對(duì)檢測(cè)過程或檢測(cè)技術(shù)本身可能存在問題缺乏了解。就HBV基因檢測(cè)而言，有一個(gè)重要問題需要在此特別提出：基因組和基因檢測(cè)的差別及其對(duì)臨床診斷可能帶來的影響。基因組和基因的關(guān)系可以簡(jiǎn)單地理解成基因組是一個(gè)整體，它由多個(gè)功能不同的基因組成，決定生物體的遺傳性狀；而基因是個(gè)體，表達(dá)某一種產(chǎn)物發(fā)揮作用，或具有調(diào)節(jié)功能。PCR法只能檢測(cè)某一個(gè)基因，或某一個(gè)基因的一部分（稱之為基因片段）。比如，HBV基因組全長(zhǎng)3.2kb左右，PCR法一般只是選擇S或C基因300500bp的片段進(jìn)行擴(kuò)增。以后還將談到，由于擴(kuò)增時(shí)必須使用引物，引物3’端一個(gè)堿基的突變將導(dǎo)致假陰性結(jié)果。而雜交法（bDNA或酶聯(lián)夾心雜交）檢測(cè)的則是HBV的基因組[3]。48組短的寡核苷酸（堿基數(shù)30個(gè)左右）在不同位點(diǎn)與HBV DNA雜交，其中10組是捕獲探針，其余為信號(hào)檢測(cè)探針。在有點(diǎn)突變的情況下，通過雜交法仍能保證有效地捕捉到目的基因，包括不同HBV基因亞型，在敏感度范圍之內(nèi)，完全可以避免發(fā)生假陽性和假陰性的結(jié)果。
    二、要重視血清標(biāo)本的正確處理
    蛋白酶裂解后酚氯仿抽提，已經(jīng)成為分離和提取血清標(biāo)本中HBV DNA的“經(jīng)典”方法。最近幾年，為簡(jiǎn)化操作過程，有人采用柱抽提法，更有一些試劑公司提供某種“保密”試劑（大多是蛋白酶之類的裂解物），投入血清后再煮沸數(shù)分鐘，即可獲得用于PCR的模板。我們認(rèn)為，無論是經(jīng)典方法還是各種改良法，都必須關(guān)注以下三個(gè)要點(diǎn)：第一，目的基因的得率；第二，操作程序的簡(jiǎn)繁程度；第三，材料和時(shí)間的消耗。
    我們比較了包括蛋白酶裂解-酚氯仿抽提、堿變性、柱抽提、加蛋白酶K裂解后煮沸和血清直接煮沸等7種血清標(biāo)本處理方法，對(duì)PCR擴(kuò)增效率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清直接煮沸法的擴(kuò)增效率最高；經(jīng)典的蛋白酶裂解-酚氯仿抽提法，不僅操作過程煩瑣，而且目的基因的得率較低；柱抽提法雖然簡(jiǎn)化了一些步驟，但耗材昂貴，而且得率明顯低于直接煮沸法。我們也嘗試了用血清標(biāo)本直接作為模板進(jìn)行PCR，結(jié)果擴(kuò)增效率最差，可能是血清中未經(jīng)滅活的某些成分抑制了Taq酶活性的緣故[4]。上述結(jié)果表明，血清直接煮沸法，不僅操作十分簡(jiǎn)便、省材省時(shí)，而且HBV DNA的得率最高（大于70%），是HBV基因檢測(cè)過程中血清標(biāo)本處理的最佳選擇。
    從上述結(jié)果引出這樣兩個(gè)問題：第一，有沒有必要采用套式（亦稱巢式）PCR，以提高血清HBV DNA的檢測(cè)率。如果能首先解決好處理標(biāo)本過程中目的基因的得率問題，那么我們就可以取得事半功倍的效果，在一定范圍內(nèi)還可以提高PCR法的特異性。第二，由于不同的抽提方法，HBV DNA的得率不同，因此，如果沒有統(tǒng)一的血清標(biāo)本處理方法，那么基因定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性如何得到保證呢？這個(gè)問題在作PCR定量時(shí)顯得尤為突出（雜交法定量若采用血清抽提物來檢測(cè)，同樣存在這個(gè)問題）。定量PCR法的原理是把“反應(yīng)管”中的目的基因指數(shù)級(jí)地?cái)U(kuò)增到一定水平，再通過產(chǎn)物雜交，并與設(shè)定的內(nèi)參照對(duì)比，推算“反應(yīng)管”內(nèi)的目的基因含量，并不等于原待測(cè)標(biāo)本內(nèi)的真正含量，因此血清標(biāo)本處理過程種的目的基因的丟失及丟失量均無法計(jì)算。熒光PCR同樣會(huì)因標(biāo)本處理不當(dāng)，使得定量結(jié)果不可靠。
    綜上所述，任何基因定量手段必須采取統(tǒng)一的標(biāo)本處理方法，同時(shí)還必須對(duì)確認(rèn)的最佳方法進(jìn)行反復(fù)比較，以確定其目的基因的得率。我們推薦血清直接煮沸法，優(yōu)越性已如前所述。
    三、要解決由于基因突變所致PCR法假陰性的問題
    1998年以前，在PCR技術(shù)普遍應(yīng)用于HBV DNA定性檢測(cè)的一段時(shí)間內(nèi)，我們常發(fā)現(xiàn)，某些HBsAg（+）、HBeAg（+）、抗HBc（+）病人，血清HBV DNA檢測(cè)陰性，似與病情不符。最近，我們將這部分標(biāo)本采用酶聯(lián)雜交法，以及多對(duì)引物PCR法復(fù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)標(biāo)本HBV DNA陽性，少數(shù)與敏感度不夠有關(guān)，過去的結(jié)果是假陰性。為進(jìn)一步探討假陰性的原因，我們改變了原來用于PCR擴(kuò)增的引物序列，即同時(shí)或分別去除兩根引物3端的最后一個(gè)堿基，再對(duì)上述HBV DNA陰性標(biāo)本行PCR擴(kuò)增，結(jié)果陽性。
    眾所周知，PCR引物設(shè)計(jì)必須遵循一定原則，選擇待測(cè)目的基因的保守區(qū)序列來設(shè)計(jì)引物，是首先要遵循的原則之一。乙型肝炎病毒基因組的S區(qū)基因最保守，C基因次之。我們?cè)�比較過S區(qū)和C區(qū)引物，對(duì)乙肝病人血清標(biāo)本擴(kuò)增結(jié)果，發(fā)現(xiàn)C區(qū)引物的陽性率為S區(qū)的70%左右。但即使是S區(qū)基因，也有一些突變頻率較高的區(qū)域或位點(diǎn)。最早確認(rèn)HBV基因擴(kuò)增引物的作者，采用了經(jīng)驗(yàn)性的方法，即選擇多對(duì)S區(qū)基因引物，擴(kuò)增大量乙肝病人的血清標(biāo)本，篩選出陽性率最高的一對(duì)引物。因?yàn)槭恰白罡摺保�不是全部，所以不可避免地存在漏檢或假陰性。從整體上看，PCR的漏檢率可能很低，但漏檢如果發(fā)生在某一個(gè)具體病人則是100%。這里也同樣產(chǎn)生了兩個(gè)問題：第一，如果某一項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)不能百分之百地避免假陰性，那么我們還有沒有可能采取更積極的措施，以最大限度地減少假陰性？第二，臨床醫(yī)生是否對(duì)HBV DNA檢測(cè)技術(shù)的局限性有足夠的認(rèn)識(shí)？是不是僅憑一張檢驗(yàn)報(bào)告的陽性或陰性結(jié)果，作出HBV感染是與否的判斷？
    與經(jīng)驗(yàn)醫(yī)學(xué)不同，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)要求臨床醫(yī)生必須不斷更新知識(shí)，必須隨時(shí)掌握各種現(xiàn)代診斷技術(shù)的基本原理和應(yīng)用范圍；同時(shí)，保持與臨床檢驗(yàn)人員的經(jīng)常性溝通也是提高和體現(xiàn)臨床醫(yī)生診療水平的一個(gè)重要方面。就HBV基因檢測(cè)技術(shù)而言，我們認(rèn)為，對(duì)有疑問的陰性結(jié)果，應(yīng)當(dāng)采用雜交或多對(duì)引物PCR等方法來補(bǔ)救。
    四、如何處理PCR產(chǎn)物污染的問題
    PCR技術(shù)因靈敏度很高和操作相對(duì)簡(jiǎn)便而在臨床上被廣泛應(yīng)用。理論上，每一反應(yīng)管內(nèi)只要有一個(gè)基因存在就可能被擴(kuò)增至可觀察水平，而在實(shí)際用于HBV基因檢測(cè)時(shí)，靈敏度也達(dá)到了100個(gè)基因/ml的水平。靈敏度過高可能會(huì)導(dǎo)致假陽性率增加，這是任何檢測(cè)技術(shù)無法避免的事實(shí)。在導(dǎo)致PCR假陽性的因素中，產(chǎn)物污染是最嚴(yán)重、但又是可以避免的因素之一。在如何正確使用PCR技術(shù)，以提高臨床診斷水平這個(gè)問題上，我國曾為之付出過沉重的代價(jià)。防止PCR產(chǎn)物污染，以避免假陽性和提高PCR診斷技術(shù)的穩(wěn)定性已成為急待解決的問題。因噎廢食，禁止使用PCR技術(shù)顯然是不明智之舉，但良策是什么？出路在哪里？
    采用一種能識(shí)別核酸雙鏈分子中的UTP并降解核酸的UNG酶，在下一次PCR之前對(duì)模板及其它反應(yīng)物進(jìn)行處理，可以防止因產(chǎn)物污染所致的假陽性。目前我國國家藥政部門在接受PCR相關(guān)檢測(cè)試劑盒申報(bào)時(shí)，已經(jīng)把是否采用了UNG酶作為審批條件之一。但在現(xiàn)階段還存在一些技術(shù)問題，其中UNG酶的活性保存非常重要。如果使用了失活的UNG酶，同時(shí)檢驗(yàn)人員因?yàn)橹�道使用了UNG酶系統(tǒng)，而放松PCR產(chǎn)物的常規(guī)處理，將會(huì)導(dǎo)致更為嚴(yán)重的后果。另外，目前UNG酶的造價(jià)不低，每一檢測(cè)人份的費(fèi)用上升比較明顯。但隨著重組UNG酶生產(chǎn)和純化技術(shù)的成熟，造價(jià)將會(huì)降低。今后，UNG酶及其相應(yīng)的系統(tǒng)將成為常規(guī)PCR檢測(cè)試劑盒的組份。
    然而，我們不能因?yàn)閁NG酶系統(tǒng)的應(yīng)用，而疏于PCR操作過程的規(guī)范化。事實(shí)上，自PCR技術(shù)誕生之日起，為保證實(shí)驗(yàn)研究的順利開展和臨床檢測(cè)的精確可靠，發(fā)明人就已經(jīng)明確規(guī)定了應(yīng)用PCR技術(shù)必須具備的實(shí)驗(yàn)室條件、人員技能和各種防污染措施。比如：具備三間可通風(fēng)、進(jìn)出有序和功能不同的工作室；各室配備專用移液器并不得互換使用；使用帶過濾芯的一次性移液頭；每次反應(yīng)均要設(shè)置陰、陽性對(duì)照；檢驗(yàn)人員必須接受專門訓(xùn)練，等等。我們的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)表明，只要嚴(yán)格按照上述規(guī)定操作，就完全可以避免產(chǎn)物污染所造成的假陽性。因此，我國今后仍必須在實(shí)驗(yàn)室管理方面加大力度，除了對(duì)試劑盒嚴(yán)格把關(guān)外，還要堅(jiān)決取締缺乏條件（包括實(shí)驗(yàn)室和人員條件）的檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)開展常規(guī)PCR檢測(cè)。
    五、基因定量檢測(cè)不應(yīng)該對(duì)靈敏度提出過高要求
    與反映機(jī)體疾病嚴(yán)重程度的某些生化指標(biāo)不同，病原體基因檢測(cè)結(jié)果的“有”和“無”（定性）要比“高”和“低”（定量）的意義更大。目前，對(duì)許多感染性疾病而言，血液和組織內(nèi)病原體含量的高低與組織損傷程度、對(duì)治療的反應(yīng)性以及預(yù)后的關(guān)系等都未完全闡明。病原體基因定量分析只有在HBV、HCV、HIV等病毒感染方面的應(yīng)用價(jià)值得到了肯定[5，6]。
    從技術(shù)角度考慮，靈敏度、特異性和精確度是考核基因定量分析方法的重要指標(biāo)，最理想的是這三項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)；但從臨床工作的需要來看，針對(duì)不同病人和疾病的不同階段，對(duì)檢測(cè)技術(shù)參數(shù)的要求有所側(cè)重。以HBV基因定量為例，使用干擾素抗病毒治療的病人，判斷療效的重要手段之一是觀察HBV基因含量的變化：在治療后的最初13個(gè)月，病毒基因呈對(duì)數(shù)級(jí)地下降，往往預(yù)示有反應(yīng)性；繼之，至某一階段降至雜交法的敏感度以下，最終病毒可能被完全清除。PCR定量技術(shù)可以把敏感度提高到檢測(cè)每毫升100個(gè)拷貝的水平[7，8]，但低于雜交檢測(cè)cut-off值（如bDNA為700000拷貝/ml）的HBV基因量，即足以充分反映抗病毒治療的效果，再進(jìn)一步量化的意義不大，在一定時(shí)間內(nèi)作定性檢查即可。因此，我們認(rèn)為，在建立和開發(fā)各種基因定量分析技術(shù)的過程中，不要脫離臨床實(shí)際過于強(qiáng)調(diào)靈敏度。
    六、基因檢測(cè)和免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)具有互補(bǔ)性
    診斷HBV感染的免疫學(xué)試驗(yàn)是著名的“兩對(duì)半”，又稱之為HBV免疫標(biāo)志物。過去由于無法對(duì)HBV感染作病原學(xué)檢查，曾一度經(jīng)津津樂道于分析“兩對(duì)半”檢測(cè)結(jié)果及其各種組合形式與感染狀態(tài)、傳染性及對(duì)治療的反應(yīng)性等問題之間的關(guān)系。最典型的例子莫過于把所謂“血清轉(zhuǎn)化（serum conversion）”，即HBeAg消失，出現(xiàn)抗-HBe看作抗病毒治療有效的標(biāo)志，后來發(fā)現(xiàn)在這些發(fā)生了“血清轉(zhuǎn)化”的病人中，有部分病人系病毒在藥物（如干擾素）的選擇或免疫壓力下產(chǎn)生了前C基因突變，不表達(dá)HBeAg，但血清HBV DNA則陽性，甚至含量很高。病毒基因變異所致的一系列病毒表型的改變，向免疫學(xué)診斷提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。基因診斷（包括突變基因分析），技術(shù)很好地解決了這個(gè)問題。有人甚至捕捉到這樣一個(gè)重要信息：在約6%的抗-HBs陽性HBV感染者的血清中，檢出HBV DNA。使我們認(rèn)識(shí)到，HBV S基因變異形成突變的包膜蛋白，使一貫被認(rèn)為是保護(hù)型抗體的抗-HBs失去中和病毒的作用。
    以上我們從一個(gè)側(cè)面闡述了基因檢測(cè)的重要性，但我們不能因此而斷言病毒基因檢測(cè)可以取代免疫學(xué)檢測(cè)。基因檢測(cè)所顯示的優(yōu)越性也恰恰是它的缺陷之所在，因?yàn)槲覀冎荒芡ㄟ^它來判斷病原體的有無和量的多少，至于病原體進(jìn)入體內(nèi)之后，機(jī)體作出了何種反應(yīng)？程度如何？反應(yīng)的結(jié)果如何？等等，基因檢測(cè)結(jié)果不能對(duì)此類問題作出全面的回答。眾所周知，感染后的免疫應(yīng)答，包括體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，是感染病學(xué)和免疫學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容，也是判斷被感染者病情、治療反應(yīng)、預(yù)后，以及流行病學(xué)調(diào)查的重要依據(jù)。客觀地講，基因檢測(cè)和免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)在目前應(yīng)當(dāng)互補(bǔ)共存，絕大多數(shù)情況下兩者缺一不可。
 

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